Diagnostico por Laboratorio

El diagnóstico de las aspergilosis se fundamenta en el conocimiento de los antecedentes clínicos y en los signos y síntomas del paciente, que, si bien suelen ser inespecíficos, guía al médico en la identificación de los órganos afectados. La imagenología (rayos X, tomografías y resonancias) aporta significativamente en el diagnóstico presuntivo y el reconocimiento de la extensión del proceso infeccioso, lo que permite la elección de las muestras clínicas y los exámenes de laboratorio para esclarecer la etiología del cuadro clínico.

Las muestras clínicas para el diagnóstico de la aspergilosis son tan variadas como las presentaciones clínicas que puede causar el hongo. Al ser un hongo ambiental de amplia distribución es importante descartar que los hallazgos correspondan a una contaminación, a una colonización o a una invasión del tejido. Debido a esto las aspergilosis, y principalmente en las formas sistémicas, suelen clasificarse como: posible (cuando se cuentan con la sospecha clínica pero no con hallazgos de laboratorio), probable (cuando a la sospecha clínica se le suma la visualización y/o aislamiento del hongo a partir de una muestra no estéril o el resultado positivo de una prueba de inmunodiagnóstico o molecular) y confirmada (cuando además de la clínica y los hallazgos de laboratorio o patología demuestran la invasión del tejido mediante biopsia o las muestras procesadas son normalmente estériles). Las muestras respiratorias son las más utilizadas para el diagnóstico de las formas pulmonares de la enfermedad. El esputo, cuando sea posible obtenerlo en buena cantidad y calidad sería la muestra ideal, pero en pacientes inmunocomprometidos, tal como los pacientes trasplantados de células madre hematopoyécticas, suelen tener cuadros respiratorios no productivo, por lo que el lavado broncoalveolar sería la muestra recomendada, no obstante, por lo invasivo del procedimiento no sería recomendado en pacientes muy debilitados. Otras muestras respiratorias como el cepillado bronquial y la biopsia pulmonar son opciones muy indicadas, pero en personas que toleren este tipo de procedimientos. Recientemente, debido a la pandemia asociada a SARS-Cov-2 y al alto número de pacientes afectados y la dificultad y riesgo de la toma y manipulación de sus muestras respiratorias, el uso del aspirado traqueal resalta por la simplicidad del procedimiento de obtención y su utilidad en el diagnóstico es similar al lavado broncoalveolar. Cuando el compromiso involucra otros órganos internos la biopsia directa del tejido sería la muestra ideal, no obstante, por la ruta de llegada del hongo a estos tejidos suele ser la hematógena puede recurrirse a los hemocultivos; sin embargo, la sensibilidad en estas muestras para el diagnóstico de aspergilosis es extremadamente baja. En las infecciones en sistema nervioso central, el líquido cefalorraquídeo tiene baja sensibilidad para directos y cultivos, pero es un poco más alta para las técnicas de inmunodiagnóstico, esto debido a que los mohos en sistema nervioso suelen causar lesiones que ocupan espacio y no están en líquido. En lesiones en piel es posible la obtención de escamas o hacer debridamento del borde de las úlceras empleando un bisturí estéril. Al ser Aspergillus spp. un moho ambiental, las muestras deben protegerse de la contaminación para la correcta interpretación de los hallazgos, principalmente de los cultivos y las técnicas moleculares. En el laboratorio las muestras podrán ser utilizadas para la realización de diferentes técnicas, incluyendo los exámenes directos, los cultivos, las técnicas de inmunodiagnóstico y la búsqueda del material genético del hongo.

● Examen directo e histopatología (microscopía)

A partir de muestras líquidas puede hacerse montaje en fresco entre lámina y laminilla. Muestras con moco, material purulento o queratina se recomienda usar el KOH al 10%, idealmente con contraste para facilitar la visualización de las estructuras más hialinas. En aspergilosis se observarían hifas septadas hialinas, frecuentemente con dicotomía (ramificación) en ángulo agudo. Estos hallazgos deben informarse como hifas hialinas ramificadas tabicadas, y es importante recordar que esta dicotomía no es exclusiva de este género y puede ser observada en las hifas de otros mohos hialinos como Fusarium spp., Scedosporium spp., Penicillium spp., entre otros. También se pueden hacer directos con tinciones rápidas como blanco de Calcofluor, Blankophor o rojo congo, las cuales incrementan la sensibilidad del examen directo por permitir la visualización de las estructuras del hongo fluorescentes, sin embargo, para esta técnica se requiere de microscopio de fluorescencia. Excepcionalmente, en los extendidos teñidos con Gram también es posible evidenciar las estructuras de Aspergillus spp. En aquellos casos donde el hongo se encuentra en tejidos húmedos y oxigenados puede producir sus estructuras de esporulación, en estos casos al examen directo se observarían, además de las hifas septadas hialinas dicotómicas en ángulo agudo, cabezuelas con fiálides y conidias.

Examen histopatológico/citológico.

Las biopsias de tejidos permiten observar las estructuras del hongo penetrando el tejido, lo que confirmaría la enfermedad (aspergilosis confirmada). En cortes de tejidos teñidos con hematoxilina eosina, plata metenamina Grocott-Gomori (GMS) o tinción con ácido peryódico Schiff (PAS) se observan hifas septadas ramificadas en ángulo agudo y, ocasionalmente, cabezuelas.

● Cultivo

Aspergillus crece bien en medios como agar Sabouraud, agar extracto de malta y en agar czapek levadura (CYA, Vzapek Yeast Agar, por sus siglas en inglés) incubados a 25 y 37 °C por 2 a 5 días. En agar micosel las secciones de Aspergillus suelen ser inhibidas por la cicloheximida, pero Aspergillus sección Terrei y sección Nidulantes pueden crecer un poco más lento de lo esperado. La apariencia macroscópica de las colonias va a variar de acuerdo con la sección, incluso a la especie, pudiendo ser algodonosa, aterciopelada o pulverulenta de colores muy diversos como blanco, amarillo, café, verde, azuloso, gris, hasta negro. Las preparaciones con azul de lactofenol a partir de las colonias permiten observar las estructuras características del género (hifas septadas hialinas, conidióforos, vesículas, fiálides, conidias, estructuras sexuales, etc), no obstante, las particularidades de estas estructuras no suelen ser suficientes para establecer la especie, pero si pueden acercar a la sección del aislamiento. Para ello se recomienda la utilización de claves taxonómicas específicas para el género Aspergillus. Para este proceso de identificación también se puede recurrir al análisis de secuencias blanco moleculares y su comparación con las bases de datos disponibles, técnicas de amplificación y análisis de restricción (RFLP), análisis multilocus (MLST), entre otras. También la espectrometría de masas MALDI-TOF permite la identificación de un número importante de especies asociadas a enfermedad en el humano, aunque todavía la base de datos es algo incompleta. La identificación, al menos a nivel de sección, es sumamente importante, debido principalmente a las diferencias a la respuesta a los tratamientos, ya que especies dentro de la sección Terrei suelen ser intrínsecamente resistentes a la anfotericina B y las de la sección Nidulantes son malas respondedoras a la terapia con azoles.

● Inmunodiagnóstico
Detección de anticuerpos

● Prueba de inmunodifusión doble de Ouchterlony: se basa en la formación de un complejo antígeno-anticuerpo que se precipita en el gel y se visualiza como una banda blanquecina. Esta técnica es de gran utilidad para el diagnóstico de las aspergilosis alérgicas, las localizadas (aspergilomas) y las formas crónicas, pero tienen poca utilidad para las formas invasivas oportunistas. El número de bandas que pueden observarse va a variar de acuerdo con la presentación clínica de la enfermedad.

● Inmunoensayo enzimático (ELISA): la detección de anticuerpos contra Aspergillus spp. por ELISA no es de uso rutinario.

Detección de antígenos

• Detección de galactomanano (ELISA): se basa en una determinación inmunoenzimática en sándwich de un solo paso que detecta el galactomanano en la pared del hongo. Esta técnica cuantitativa está disponible para su utilización en suero y muestras respiratorias. El ensayo del galactomanano está incluido dentro de las guías diagnósticas europeas y norteamericanas para el diagnóstico de las aspergilosis. Debido a que el galactomanano no es exclusivo de Aspergillus spp. pueden presentarse falsos positivos en pacientes con infecciones por otros hongos, que están recibiendo ciertos tratamientos con antibióticos.

• Inmunocromatografía (ensayo de flujo lateral): esta técnica considerada POC (Point of Care) o POCT (Pruebas de laboratorio en el lugar de asistencia) por su fácil realización sin necesidad de equipos, determina de manera cualitativa o semicuantitativa el galactomanano de Aspergillus sp. en las muestras de pacientes con la enfermedad. Es una técnica que por su sencillez, economía y buena sensibilidad y especificidad se ha convertido en una opción diagnóstica de amplio uso.

• Cromatografía de gases acoplada a masas para la detección de compuestos volátiles: permite la detección de compuestos volátiles liberados por los microorganismos durante su metabolismo. De utilidad en el diagnóstico de infecciones pulmonares por Aspergillus spp.

● Pruebas moleculares

La detección de los ácidos nucleicos se puede lograr mediante la amplificación de genes blanco específicos o con métodos panfúngicos seguidos de secuenciación del fragmento amplificado. La mayoría de las pruebas moleculares usan muestras biológicas como sangre total, seguida de lavado bronco alveolar; asimismo se han empleado tejidos frescos y procesados en parafina y otros líquidos corporales. Se han diseñado PCR “in house” y existen estuches comerciales para la búsqueda del material genético de Aspergillus spp. en muestras clínicas, no obstante, al ser este hongo un contaminante común del ambiente, la interpretación de los resultados debe ser cuidadosa para evitar falsos positivos.

Galeria Aspergilosis